Масштабирование: подробное руководство по промышленной ферментации

Ферментация является краеугольным камнем многих отраслей, от пищевой промышленности и производства напитков до фармацевтики и биотоплива. Хотя успешная ферментация в лабораторных условиях является значительным достижением, перенос этого успеха на коммерческое производство требует тщательного планирования, исполнения и оптимизации. Это руководство представляет собой всеобъемлющий обзор ключевых соображений и лучших практик для масштабирования процессов промышленной ферментации.

Почему масштабирование ферментации является сложной задачей?

Масштабирование процесса ферментации — это не просто увеличение объема. Несколько факторов, которые легко контролировать в малых масштабах, становятся значительно сложнее по мере роста процесса. К ним относятся:

• Теплопередача: Поддержание оптимальной температуры имеет решающее значение для роста микроорганизмов и образования продукта. Более крупные биореакторы имеют меньшее соотношение площади поверхности к объему, что усложняет отвод тепла. Недостаточное охлаждение может привести к перегреву и гибели клеток, в то время как чрезмерное охлаждение может замедлить процесс ферментации.
• Массоперенос: Перенос кислорода часто является лимитирующим фактором в аэробных ферментациях. По мере увеличения плотности культуры потребность в кислороде возрастает. Обеспечение адекватной подачи кислорода по всему биореактору становится все более сложной задачей в больших масштабах. Перемешивание, барботирование и конструкция реактора играют решающую роль в эффективности переноса кислорода.
• Перемешивание: Эффективное перемешивание необходимо для поддержания гомогенности, распределения питательных веществ и удаления метаболических побочных продуктов. Плохое перемешивание может привести к градиентам pH, температуры и концентрации питательных веществ, что может негативно сказаться на росте клеток и образовании продукта. Необходимо тщательно продумать тип и конфигурацию мешалок, конструкцию отражательных перегородок и скорость перемешивания.
• Сдвиговое напряжение: Чрезмерное сдвиговое напряжение от мешалок может повредить клетки, особенно те, которые чувствительны к сдвигу. Оптимизация конструкции мешалки и скорости перемешивания имеет решающее значение для минимизации сдвигового напряжения при сохранении адекватного перемешивания. Некоторые клетки (например, нитчатые грибы) более подвержены повреждению от сдвига, чем другие.
• Стерильность: Поддержание стерильности имеет первостепенное значение в процессах ферментации. Риск контаминации увеличивается с размером и сложностью биореактора. Надежные процедуры стерилизации, асептические методы и закрытые системы необходимы для предотвращения контаминации и обеспечения качества продукции.
• Контроль pH: Поддержание оптимального диапазона pH критически важно для активности ферментов и жизнеспособности клеток. По мере протекания ферментации производство кислот или оснований может вызывать значительные колебания pH. Точный контроль pH требует сложных систем мониторинга и управления.
• Мониторинг и контроль процесса: Эффективный мониторинг и контроль критических параметров процесса (например, температуры, pH, растворенного кислорода, уровней питательных веществ) имеет решающее значение для стабильной производительности и качества продукции. Системы мониторинга в реальном времени и автоматизированные системы управления необходимы для крупномасштабных ферментаций.
• Масштабно-зависимые метаболические сдвиги: Клетки могут вести себя по-разному в крупномасштабных ферментерах по сравнению с мелкомасштабными культурами. Такие факторы, как доступность кислорода, сдвиговое напряжение и градиенты питательных веществ, могут изменять метаболические пути и влиять на выход и качество продукта. Эти сдвиги необходимо тщательно изучать и учитывать при масштабировании.

Этапы масштабирования ферментации

Процесс масштабирования обычно включает несколько этапов, каждый со своими целями и задачами:

1. Разработка посевной культуры

Посевная культура служит инокулятом для производственного ферментера. Крайне важно разработать здоровую, активно растущую и свободную от контаминации посевную культуру. Обычно это включает несколько стадий роста, начиная от криоконсервированной стоковой культуры и продолжая через колбы для встряхивания, малые биореакторы и, в конечном итоге, до посевного ферментера. Посевная культура должна быть физиологически схожа с клетками, которые требуются в производственном ферментере.

Пример: Фармацевтическая компания, разрабатывающая новый антибиотик, может начать с замороженного стока микроорганизма-продуцента. Этот сток восстанавливают в колбе для встряхивания, затем переносят в малый (например, 2 л) биореактор. Биомасса из этого биореактора затем инокулирует более крупный (например, 50 л) посевной ферментер, который обеспечивает инокулят для производственного ферментера.

2. Пилотная ферментация

Пилотная ферментация устраняет разрыв между лабораторным и промышленным производством. Она позволяет тестировать и оптимизировать процесс ферментации в условиях, более близких к полномасштабной производственной среде. Исследования на пилотном уровне помогают выявить потенциальные проблемы масштабирования и уточнить рабочие параметры. В этих экспериментах обычно используются биореакторы объемом от 50 до 500 л.

Пример: Компания по производству биотоплива может использовать 100-литровый биореактор для оценки производительности нового генетически модифицированного штамма дрожжей для производства этанола. Они будут оптимизировать такие параметры, как температура, pH и скорость подачи питательных веществ, чтобы максимизировать выход и производительность этанола.

3. Промышленная ферментация

Заключительный этап — это промышленная ферментация, на которой продукт производится в больших количествах для коммерческой продажи. Объем производственных биореакторов может варьироваться от нескольких тысяч до сотен тысяч литров. Поддержание стабильной производительности и качества продукции в таком масштабе требует тщательного внимания к деталям и надежных систем управления процессом.

Пример: Пивоваренный завод может использовать ферментер объемом 10 000 л для производства пива в промышленных масштабах. Они будут тщательно контролировать температуру, pH и уровень растворенного кислорода для обеспечения стабильного вкуса и качества.

Ключевые аспекты масштабирования ферментации

1. Конструкция биореактора

Биореактор — это сердце процесса ферментации. Выбор правильной конструкции биореактора имеет решающее значение для успешного масштабирования. Ключевые соображения включают:

• Тип биореактора: Различные типы биореакторов подходят для разных применений. Реакторы с механическим перемешиванием являются наиболее распространенным типом, но существуют и другие варианты, такие как эрлифтные реакторы, барботажные колонны и реакторы с насадочным слоем. Выбор зависит от конкретных требований процесса ферментации, таких как тип микроорганизма, потребность в кислороде и чувствительность к сдвиговому напряжению.
• Система перемешивания: Система перемешивания должна обеспечивать адекватное смешивание для гомогенности, распределения питательных веществ и переноса кислорода. Распространенные типы мешалок включают турбины Раштона, лопастные турбины с наклонными лопатками и морские пропеллеры. Количество и конфигурация мешалок, конструкция отражательных перегородок и скорость перемешивания должны быть оптимизированы для конкретного биореактора и процесса ферментации.
• Система барботирования: Система барботирования вводит воздух или кислород в биореактор. Тип и размер барботера, скорость потока газа и его состав должны тщательно контролироваться для оптимизации переноса кислорода без чрезмерного пенообразования или повреждения клеток.
• Система теплопередачи: Система теплопередачи должна поддерживать в биореакторе оптимальную температуру для роста клеток и образования продукта. Обычно это включает в себя сосуд с рубашкой с циркулирующей охлаждающей или нагревающей жидкостью. Теплопередающая способность должна быть достаточной для отвода тепла, выделяемого в процессе ферментации.
• Приборы и управление: Биореактор должен быть оснащен датчиками и системами управления для мониторинга и регулирования критических параметров процесса, таких как температура, pH, растворенный кислород и уровни питательных веществ. Автоматизированные системы управления необходимы для поддержания стабильной производительности и качества продукции.

2. Оптимизация процесса

Оптимизация процесса включает в себя определение и оптимизацию ключевых параметров процесса, которые влияют на рост клеток, образование продукта и его качество. Обычно это включает комбинацию экспериментальных исследований и математического моделирования.

• Оптимизация среды: Ферментационная среда должна обеспечивать все питательные вещества, необходимые для роста клеток и образования продукта. Оптимизация состава среды может значительно улучшить выход и производительность продукта. Это может включать изменение концентраций источников углерода, источников азота, витаминов и минералов. Для эффективной оптимизации состава среды могут использоваться статистические методы планирования эксперимента, такие как методология поверхности отклика (RSM).
• Оптимизация температуры: Оптимальная температура для роста клеток и образования продукта зависит от конкретного микроорганизма. Температура может влиять на активность ферментов, текучесть мембран и стабильность белков. Оптимальная температура должна быть определена экспериментально.
• Оптимизация pH: Оптимальный диапазон pH для роста клеток и образования продукта также зависит от конкретного микроорганизма. pH может влиять на активность ферментов, проницаемость клеточной мембраны и растворимость белков. Точный контроль pH необходим для оптимальной производительности ферментации.
• Оптимизация растворенного кислорода: Поддержание адекватного уровня растворенного кислорода имеет решающее значение для аэробных ферментаций. Оптимальный уровень растворенного кислорода зависит от потребности микроорганизма в кислороде и кислородопереносящей способности биореактора. Уровни растворенного кислорода можно контролировать, регулируя скорость перемешивания, скорость аэрации и обогащение кислородом.
• Стратегии подпитки: Для периодических с подпиткой и непрерывных ферментаций скорость и состав подпитки должны быть тщательно оптимизированы для максимизации выхода и производительности продукта. Стратегии управления с обратной связью могут использоваться для регулировки скорости подпитки на основе измерений концентрации глюкозы, pH или растворенного кислорода в реальном времени.

3. Мониторинг и управление

Эффективный мониторинг и управление критическими параметрами процесса необходимы для стабильной производительности и качества продукции. Это требует использования соответствующих датчиков, систем управления и методов анализа данных.

• Датчики: Для мониторинга критических параметров процесса доступны различные датчики, включая температуру, pH, растворенный кислород, концентрацию глюкозы, концентрацию биомассы и концентрацию продукта. Выбор датчика зависит от конкретного измеряемого параметра и требований процесса ферментации.
• Системы управления: Автоматизированные системы управления используются для регулирования параметров процесса на основе обратной связи от датчиков. Распространенные системы управления включают ПИД-регуляторы (пропорционально-интегрально-дифференциальные), которые регулируют управляемые переменные (например, температуру, pH, скорость перемешивания) для поддержания желаемых заданных значений.
• Анализ данных: Данные, собранные с датчиков и систем управления, могут быть проанализированы для выявления тенденций, обнаружения аномалий и оптимизации производительности процесса. Методы статистического управления процессами (SPC) могут использоваться для мониторинга изменчивости процесса и выявления потенциальных проблем до того, как они повлияют на качество продукции.
• Процессно-аналитическая технология (PAT): PAT — это система для проектирования, анализа и контроля производственных процессов посредством своевременных измерений критических атрибутов качества (CQA) и критических параметров процесса (CPP). PAT направлена на улучшение понимания процесса, снижение изменчивости и повышение качества продукции.

4. Обеспечение стерильности

Поддержание стерильности является первостепенной задачей в процессах ферментации. Контаминация может привести к порче продукта, снижению выхода и даже полному сбою процесса. Внедрение надежных процедур стерилизации и асептических методов является обязательным.

• Стерилизация оборудования: Все оборудование, которое контактирует с ферментационной средой, включая биореактор, трубопроводы и датчики, должно быть тщательно стерилизовано перед использованием. Стерилизация паром является наиболее распространенным методом, но существуют и другие варианты, такие как автоклавирование, фильтрация и химическая стерилизация.
• Стерилизация сред: Ферментационная среда также должна быть стерилизована для устранения любых контаминирующих микроорганизмов. Обычно это делается путем автоклавирования или фильтрационной стерилизации.
• Асептические методы: Все операции, связанные с открытием биореактора или введением материалов в ферментационную среду, должны выполняться с использованием асептических методов. Это включает использование стерильного оборудования, ношение стерильных перчаток и работу в чистой среде.
• Фильтрация воздуха: Воздух, поступающий в биореактор, должен фильтроваться через стерильные фильтры для удаления любых микроорганизмов из воздуха.
• Закрытые системы: Использование закрытых систем минимизирует риск контаминации. Это включает соединение всего оборудования и трубопроводов в замкнутый контур и избегание любых открытых передач материалов.

5. Контроль пенообразования

Пенообразование — частая проблема в процессах ферментации, особенно с участием белков или поверхностно-активных веществ. Избыточная пена может привести к снижению массопереноса кислорода, контаминации и потере продукта. Пену можно контролировать добавлением пеногасителей или использованием механических пеногасителей.

• Пеногасители: Пеногасители — это химические вещества, которые снижают поверхностное натяжение ферментационной среды, предотвращая образование пены. Распространенные пеногасители включают силиконы, растительные масла и жирные кислоты. Выбор пеногасителя зависит от конкретного процесса ферментации и чувствительности микроорганизма.
• Механические пеногасители: Механические пеногасители используют вращающиеся лопасти или другие устройства для физического разрушения пены. Они часто используются в сочетании с пеногасителями.

Стратегии успешного масштабирования

1. Подход QbD (Качество через проектирование)

QbD — это систематический подход к разработке, который начинается с предопределенных целей и подчеркивает понимание продукта и процесса, а также управление процессом. Применение принципов QbD к масштабированию ферментации помогает обеспечить стабильное качество и производительность продукта.

Ключевые элементы QbD включают:

• Определение целевого профиля качества продукта (QTPP): QTPP описывает желаемые характеристики конечного продукта, такие как чистота, активность и стабильность.
• Определение критических атрибутов качества (CQA): CQA — это физические, химические, биологические или микробиологические свойства, которые необходимо контролировать для обеспечения желаемого качества продукта.
• Определение критических параметров процесса (CPP): CPP — это параметры процесса, которые могут влиять на CQA.
• Установление пространства проектных параметров: Пространство проектных параметров — это многомерная комбинация и взаимодействие входных переменных (например, CPP) и параметров процесса, которые, как было продемонстрировано, обеспечивают гарантию качества. Работа в пределах пространства проектных параметров гарантирует, что продукт соответствует желаемым атрибутам качества.
• Реализация стратегии контроля: Стратегия контроля описывает, как будут отслеживаться и контролироваться CPP, чтобы гарантировать, что процесс остается в пределах пространства проектных параметров и что продукт соответствует желаемым атрибутам качества.

2. Вычислительная гидродинамика (CFD)

CFD — это мощный инструмент для моделирования потоков жидкости, теплопередачи и массопереноса в биореакторах. Моделирование с помощью CFD можно использовать для оптимизации конструкции биореактора, систем перемешивания и барботирования. Оно также может помочь выявить потенциальные проблемы, такие как застойные зоны и точки с высоким сдвиговым напряжением. CFD может сократить количество дорогостоящих и трудоемких пилотных экспериментов, необходимых для масштабирования.

3. Уменьшенные модели

Уменьшенные модели — это маломасштабные биореакторы, разработанные для имитации условий в крупномасштабном производственном биореакторе. Уменьшенные модели можно использовать для изучения влияния различных параметров процесса на рост клеток, образование продукта и его качество. Их также можно использовать для устранения проблем, возникающих при масштабировании. Хорошо охарактеризованные уменьшенные модели могут предоставить ценную информацию и ускорить процесс разработки.

4. Моделирование и симуляция процесса

Моделирование и симуляция процесса могут использоваться для прогнозирования поведения процесса ферментации в различных масштабах и при различных рабочих условиях. Математические модели могут быть разработаны на основе фундаментальных принципов массопереноса, теплопередачи и кинетики реакций. Эти модели можно использовать для оптимизации параметров процесса, разработки стратегий управления и устранения неполадок. Для моделирования и симуляции процесса могут использоваться такие инструменты, как MATLAB, gPROMS и Aspen Plus.

Аспекты последующей обработки (Downstream Processing)

Аспекты масштабирования выходят за рамки самого процесса ферментации. Последующая обработка (downstream processing), которая включает в себя разделение и очистку продукта из ферментационной среды, также требует масштабирования. Выбор методов последующей обработки зависит от природы продукта, его концентрации и желаемой чистоты. Общие методы последующей обработки включают:

• Отделение клеток: Удаление клеток из ферментационной среды часто является первым шагом в последующей обработке. Это можно сделать путем центрифугирования, фильтрации или микрофильтрации.
• Разрушение клеток: Если продукт является внутриклеточным, клетки необходимо разрушить, чтобы высвободить продукт. Это можно сделать механическими методами (например, гомогенизация, измельчение шариками) или химическими методами (например, ферментативный лизис).
• Изоляция продукта: Продукт можно выделить из ферментационной среды с помощью различных методов, включая осаждение, экстракцию и адсорбцию.
• Очистка продукта: Продукт обычно очищают с помощью хроматографических методов, таких как аффинная хроматография, ионообменная хроматография и эксклюзионная хроматография.
• Формуляция продукта: Заключительным этапом последующей обработки является приведение продукта в стабильную и пригодную для использования форму. Это может включать добавление вспомогательных веществ, стабилизаторов и консервантов.

Мировые примеры успешного масштабирования ферментации

Несколько отраслей по всему миру в значительной степени зависят от успешного масштабирования ферментации. Вот несколько примеров:

• Фармацевтическая промышленность (по всему миру): Производство антибиотиков, вакцин и других биофармацевтических препаратов зависит от крупномасштабной ферментации микроорганизмов или клеточных культур. Компании, такие как Pfizer, Roche и Novartis, управляют огромными ферментационными мощностями по всему миру.
• Пищевая промышленность и производство напитков (Европа, Северная Америка, Азия): Производство пива, вина, йогурта, сыра и других ферментированных продуктов и напитков основано на контролируемых процессах ферментации. Компании, такие как Anheuser-Busch InBev (Бельгия), Danone (Франция) и Kirin Brewery (Япония), совершенствовали масштабирование ферментации на протяжении многих лет.
• Биотопливная промышленность (Бразилия, США): Производство этанола из сахарного тростника (Бразилия) и кукурузы (США) включает крупномасштабную ферментацию сахаров дрожжами. Компании, такие как Raizen (Бразилия) и Archer Daniels Midland (США), управляют крупномасштабными предприятиями по производству биотоплива.
• Промышленная биотехнология (Дания, Германия, Китай): Производство ферментов, биопластиков и других продуктов на биологической основе основано на ферментации генетически модифицированных микроорганизмов. Компании, такие как Novozymes (Дания), BASF (Германия) и Amyris (США), являются лидерами в этой области.

Устранение распространенных проблем при масштабировании

Несмотря на тщательное планирование и выполнение, при масштабировании ферментации все равно могут возникать проблемы. Вот некоторые распространенные проблемы и возможные решения:

• Снижение выхода продукта: Это может быть связано с изменениями в метаболических путях, ограничениями по питательным веществам или накоплением ингибирующих побочных продуктов. Пересмотрите состав среды, оптимизируйте стратегии подпитки и обеспечьте адекватный перенос кислорода.
• Повышенный риск контаминации: Это может быть связано с неадекватными процедурами стерилизации или нарушениями асептической техники. Пересмотрите протоколы стерилизации, улучшите фильтрацию воздуха и внедрите более строгие асептические процедуры.
• Избыточное пенообразование: Это может быть связано с изменениями в составе среды или физиологии клеток. Оптимизируйте добавление пеногасителя или установите механический пеногаситель.
• Изменения в морфологии клеток: Это может быть связано с изменениями сдвигового напряжения или градиентов питательных веществ. Оптимизируйте конструкцию мешалки, скорость перемешивания и стратегии подпитки.
• Нестабильность продукта: Это может быть связано с изменениями pH, температуры или наличием разлагающих ферментов. Оптимизируйте параметры процесса и добавляйте стабилизаторы в среду.

Будущие тенденции в масштабировании ферментации

Область ферментации постоянно развивается. Некоторые из ключевых тенденций, которые формируют будущее масштабирования ферментации, включают:

• Непрерывная ферментация: Непрерывная ферментация предлагает несколько преимуществ по сравнению с периодической ферментацией, включая более высокую производительность, более низкие эксплуатационные расходы и более стабильное качество продукции.
• Одноразовые биореакторы: Одноразовые биореакторы устраняют необходимость в очистке и стерилизации, снижая риск контаминации и упрощая операции.
• Передовое управление процессом: Передовые методы управления процессом, такие как модельно-прогностическое управление (MPC) и машинное обучение, используются для оптимизации процессов ферментации в режиме реального времени.
• Синтетическая биология: Синтетическая биология используется для инженерии микроорганизмов с улучшенными метаболическими возможностями и продуктивностью.
• Микробные сообщества: Использование микробных сообществ и консорциумов может открыть новые метаболические пути и повысить эффективность биопроцессов.

Заключение

Масштабирование процессов промышленной ферментации — это сложный, но необходимый шаг для вывода биопродуктов на рынок. Тщательно учитывая ключевые факторы, рассмотренные в этом руководстве, включая конструкцию биореактора, оптимизацию процесса, мониторинг и управление, обеспечение стерильности и контроль пенообразования, компании могут успешно масштабировать свои процессы ферментации и достигать стабильного качества и производительности продукции. Внедрение новых технологий и методологий, таких как QbD, CFD, уменьшенные модели и передовые системы управления процессами, будет способствовать дальнейшему повышению эффективности и надежности операций по промышленной ферментации во всем мире.